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Última actualización [03/09/2006]


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Exagerada producción de superóxido por los neutrófilos de pacientes con hepatitis alcohólica aguda: implicancia terapéutica




Milagros Dávalos Moscol, Mary Clapperton, John O''Grady y Nancy Rolando

PERU
La Hepatitis Alcohólica constituye la expresión mas severa de la enfermedad hepática inducida por el alcohol. Evidencia actual indica que el mecanismo básico de la injuria hepática sería una exagerada respuesta inflamatoria mediada por los neutrófilos. Esta entidad tiene un cuadro clínico sugestivo, hallazgos histopatológicos característicos y un pronóstico sombrío. Investigación reciente ha revelado que existe una compleja red de comunicaciones intra e intercelulares, que involucra a los hepatocitos, células endoteliales, monocitos, linfocitos, neutrófilos, así como a las células de Ito y a las células de Kupffer; esta red origina una masiva migración de neutrófilos desde el torrente sanguíneo hacia el tejido hepático. Una vez que los neutrófilos llegan al hígado, diversas citoquinas producidas localmente por el endotelio, los hepatocitos y las células de Kupffer incrementan aún más su actividad. Esta hiperactivación de los neutrófilos causa gran producción de peróxido de hidrógeno y de radicales libres de oxígeno (principalmente superóxido).

Actualmente la manera más confiable de determinar la función y el grado de activación de los neutrófilos es a través de la determinación de su producción de superóxido.

Se estudiaron 31 pacientes con hepatitis alcohólica, 20 pacientes con hepatopatía alcohólica compensada y 17 controles sanos. Los pacientes con hepatitis alcohólica y hepatopatía alcohólica compensada fueron incluidos en el estudio al momento del ingreso al hospital, siempre y cuando no tuvieran evidencia de infección, sangrado digestivo o insuficiencia renal.

Los niveles de producción de superóxido fueron similares en los tres grupos en estado basal. Luego del estímulo con zymosan opsonizado, hubo mayor incremento en la producción de superóxido por los neutrófilos provenientes de los pacientes con hepatitis alcohólica, en relación con la de los pacientes con hepatopatía alcohólica compensada y los controles sanos. Este incremento fue estad ísticamente significativo cuando se empleo fMLP como estímulo (p<0.05). Esta es una técnica que puede ser útil en la evaluación de los diversos regímenes terapéuticos utilizados en el tratamiento de la hepatitis alcohólica.

Alcoholic hepatitis represents the most severe form of alcoholic liver disease Recent research points to an exaggerated inflammatory response, mediated by neutrophils, as the basic mechanism of liver damage. This entity has a distinctive clinical picture and a characteristic histopathology and a poor outcome. Recent investigation reveals a complex network of intracellular and intercellular communication signals involving hepatocytes, endothelial cells, monocytes, lymphocytes, neutrophils, Ito and Kupffer cells, leading to massive migration of neutrophils from blood to liver. When neutrophils reach the liver, multiple cytokines produced locally by endothelium, hepatocytes and Kupffer cells, up-regulate their function. Activation of neutrophils leads to increased production of oxygen radicals (mainly superoxide) and hydrogen peroxide production.

To date there is general agreement that measurement of superoxide production by neutrophils is a reliable way of determining neutrophil function and its activation.

Thirty one patients with acute alcoholic hepatitis, twenty with compensated alcoholic liver disease and seventeen controls were studied. Patients with alcoholic hepatitis and alcoholic liver disease were enrolled on admission to the hospital and if they had no features of infection, bleeding or renal failure. The neutrophil stimuli used were opsonized zymosan and fMLP.

The production of superoxide was similar in the three groups when neutrophils were not stimulated. After stimulation with opsonized zymosan, there was an increase in the production of superoxide from patients with acute alcoholic hepatitis in comparison to those with alcoholic liver disease and controls. This increase was statistically significant when fMLP was the stimulant (p<0.05). This is a reliable technique that can be use in the evaluation of different therapeutic modalities in acute alcoholic hepatitis

INTRODUCCIÓN
La Hepatitis Alcohólica Aguda (HAA) constituye la forma mas severa de la enfermedad hepática inducida por el alcohol (1,2). Esta entidad clínica tiene un cuadro clínico orientador y características histopatológicas bien definidas. (1,3). El pronóstico es desfavorable y la mortalidad elevada. (4-6)

Investigación reciente señala que el daño inflamatorio característico de este proceso estaría en relación con una actividad incrementada de los polimorfonucleares neutrófilos. (7-10). En este proceso están involucrados una compleja red de comunicaciones intra e intercelulares, entre los hepatocitos, células endoteliales, monocitos, linfocitos, neutrófilos, así como con las células de Ito y células de Kupffer. Estas señales originan una masiva migración de neutrófilos desde el torrente sanguíneo hacia el tejido hepático ( 7,8,11-17). Una vez que los neutrófilos llegan al hígado, múltiples citoquinas producidas a nivel local por el endotelio y células de Kupffer, incrementan aún más la actividad inflamatoria de estos (9). La activación de los neutrófilos origina una producción incrementada de radicales libres de oxigeno (iones superoxido y peróxido de hidrogeno). (17,18).

Williams y Barry, (10) fueron los primeros en sugerir que la generación de radicales libres de oxigeno por los neutrófilos podría ser el principal mecanismo de lesión celular en la HAA.

Actualmente la manera más confiable de determinar la función y activación de los neutrófilos es determinando su producción de ion superoxido.(19-21).

Este trabajo tiene por finalidad la de analizar la producción de superoxido por los neutrófilos de pacientes con HAA y compararla con la de provenientes de pacientes con enfermedad hepática alcohólica compensada y controles normales.

Pacientes y métodos
El presente es un estudio in Vitro, prospectivo-controlado donde se analiza la producción de superoxido por los neutrófilos provenientes de pacientes con HAA, cirrosis hepática de etiología alcohólica compensada y controles normales.

Pacientes y controles. La presente investigación se realizó durante un año (Setiembre 1997 a Junio 1998) en el "Institute of Liver Studies" del Hospital King"s College de Londres.

Se estudiaron 31 pacientes con hepatitis alcohólica aguda , 20 pacientes con cirrosis compensada de etiología alcohólica y 20 trabajadores de salud (controles sanos). La medición de la producción de superoxido se hizo al momento de ingreso en todos los pacientes. El diagnóstico de HAA se baso en los criterios señalados en la tabla 1.

TABLA N° 1


Criterios diagnósticos de Hepatitis Alcohólica
La presencia de los siguientes criterios:
1. Historia de intenso consumo de alcohol. *
2. Ausencia de otra causa de enfermedad hepática
3. Bilirrubina sérica > 100 µmol/litro (VN 3-20 µmol/litro)
Asociado a por los menos uno de los siguientes criterios considerados como adicionales
1. AST en suero superior a 300 UI/litro (VN 10-50 UI/litro)
2. Inmunoglobulina A > 5 gr/litro (VN 0.78-4.8 gr/litro)
3. Leucocitos > 20 x 109/litro (en ausencia de sepsis)
4. Evidencia ecografica de esteatosis hepática
* Intenso consumo de alcohol: · > 80 gr/día en los varones · > 60 gr/día en mujeres · En ambos casos durante por lo menos un mes previo al diagnósticoCuando fue posible, se confirmo el diagnostico con biopsia hepática.
Criterios de exclusión
1. Sepsis activa
2. Sangrado gastrointestinal
3. Presencia de shock de cualquier etiología.
4. Insuficiencia renal
5. Evidencia de enfermedad hepática concomitante de otra etiología
6. Gestación o lactancia
7. Casos con historia de alergia a cualquiera de las drogas que se utilizaran en el estudio.
8. Presencia de neoplasia.


Pacientes con HAA y con cirrosis de etiología alcohólica fueron incluidos solo si no tenían evidencia de infección, sangrado digestivo o insuficiencia renal. Otro criterio de exclusión fue la presencia de antígeno positivo para la hepatitis B o C o la presencia de anticuerpos para el virus del SIDA. También fueron excluidos pacientes con hepatoma. Consentimiento por escrito fue obtenido de todos los pacientes y controles.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Etica del Hospital "Kings College de Londres".

Muestras de sangre. Se obtuvieron dos muestras de sangre, una de 3 mililitros que se utilizo para la opsonización del zymosan; y otra de 10 ml (anticoagulada con EDTA) que se utilizo para la separación de los neutrófilos.

Medición de la producción de superoxido. Las diversas sustancias utilizadas en el experimento se obtuvieron de los laboratorios Nycomed de Birminghan (UK) y de los laboratorios Sigma, Poole , Dorset, Reino Unido. Se utilizo además el equipo automático de lectura para reacciones inmunes (ELISA) modelo MR5000

Separación de neutrófilos. La separación de los neutrófilos se realizo inmediatamente, siguiendo la técnica descrita por Boyun (añadiendo 1 ml de dextran al 6% y dejándolo reposar por 45 minutos. (22).

Opsonización de zymosan. La opsonización de zymosan fue realizada siguiendo la técnica descrita por Beswick y col. (23).

Medición del superoxido. La medición de la producción del superoxido se realizó utilizando una modificación de la técnica descrita por Pick y Mizel. (24). La generación de O2- se cuantifico midiendo el nivel de reducción del ferrocitocromo C. Esta medición se comparo con los niveles obtenidos después de la utilización de superoxido dismutasa para inhibir la reducción. La medición se hizo con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 550 nm en un microplato de 96- hoyos.

Cada hoyo del microplato contenía lo siguiente: 25*l de citocromo C a una concentración de 18 mg/ml y 50*l de zymosan opsonizado o 50*l de fMLP a una concentración de 10-6. Los hoyos control contenían 50*l de solución salina balanceada de Hanks (HBSS). Cada hoyo del micro plato se comparó con otro exactamente igual pero que contenía 25*l de superoxido dismutasa a una concentración de 0.84 mg/ml.

La producción de superoxido se iniciaba al añadirse 50*l de la solución de neutrófilos del paciente (o del control) a una concentración de 2.5 x 106 células/ml en cada hoyo.

El cambio en la absorción de luz a 550 nm se determinó inmediatamente, así como a los 15, 30 y 45 minutos, utilizando un equipo de lectura para ELISA..

Para lograr un adecuado análisis de la función de los neutrófilos se decidió utilizar dos estimulantes, zymosan (después de haber sido opsonizado con suero del banco de controles) y fMLP. El zymosan es un derivado de la membrana celular del hongo Saccharomyces cerevisiae, y es un estimulante biológico de la función de los neutrófilos. El fMLP es un agente químico que estimula la función de los neutrófilos de manera indirecta.

La cantidad total de superoxido producido se calculó y expresó en nmol por cada 10-6 células. Todas las variable fueron medidas por triplicado.

Análisis estadístico. Todos los resultados se expresan como promedios ± estándar error de la media ( SEM). Se utilizo la prueba de Mann-Whitney para evaluar las diferencias entre los grupos de pacientes y el grupo control

RESULTADOS
Los datos clínicos y de laboratorio de los pacientes con HAA y con cirrosis de etiología alcohólica compensada se muestran en la tabla 2.

TABLA N° 2

Características clínicas y de laboratorio de los pacientes con HAA y enfermedad hepática alcohólica compensada


DHAA Cirrosis alcohólica compensada
Edad43 ± 8.649.0 ± 12.3
Child-Pugh: clasificaciónA 415
B 113
C 161
INR 1.9 ± 0.91.2 ± 0.6
Leucocitos 17078.5 ± 843359167 ± 2545.1
Neutrófilos13657 ± 8078.4 3976 ± 2216.1
Bilirrubina 442.6 ± 221.555.1 ± 52.8
Albúmina26.4 ± 4.333.6 ± 7.1
AST96.8 ± 41.348.1 ± 31.0
GGT282.3 ± 241.2 221.8 ± 307.2


Cuando los neutrófilos no eran estimulados (es decir cuando se uso HBSS), la producción de superoxido fue similar en los tres grupos. Luego del estimulo con zymosan opsonizado, hubo un incremento en la producción de superoxido por los neutrófilos provenientes de pacientes con HAA.

Cuando el estimulante fue el fMLP la producción de superoxido por los neutrófilos de los pacientes con HAA fue significativamente mayor que la proveniente de pacientes con cirrosis alcohólica o controles (p<0.05) (Tabla 3).

TABLA N° 3

Niveles de producción de superóxido en los pacientes con HAA, cirrosis alcohólica compensada y controles normales

GruposEstimulante Producción de Superóxido
nmol/10
6 células ± ds
Hepatitis alcohólica aguda
(n=31)
HBSS299.5 ± 202.3
Zymosan opsonizado1117.9 ± 243.9
FMLP746.6 ± 324.6
Cirrosis alcohólica compensada
(n=25)
HBSS240.4 ± 140.7
Zymosan opsonizado967.9 ± 225.5
FMLP506 ± 289.4
Grupo contro
(n=25)
HBSS202.9 ± 146.7
Zymosan opsonizado1015 ± 244.9
FMLP664.4 ± 268.4


DISCUSIÓN
El alcohol es el agente tóxico que mas se consume en el mundo. Diversos estudios han demostrado que el daño hepático inducido por el alcohol tienen relación con la cantidad y el tiempo de consumo (1,2, 25-27). Los pacientes en este estudio no tenían infección viral concomitante, es sabido que la infección viral concomitante puede incrementar el daño hepático. Otros factores tales como la predisposición genética, y el consumo de otros agentes hepatotóxicos que también incrementan el daño hepatotóxico del alcohol no fueron investigados en este grupo de pacientes.

El daño hepático inducido por el alcohol puede variar desde una infiltración grasa hasta cuadros de hepatitis o cirrosis con características histológicas claramente definidas. (3). De todo el espectro de daño hepático producido por el abuso del alcohol, la hepatitis alcohólica aguda es quizá la forma más severa y potencialmente fatal. (4-6).

La histopatología y estudios experimentales han sugerido que los neutrófilos, pueden jugar un papel importante en la patogenicidad del daño hepático producido por el alcohol. A pesar que en la fase inicial de daño hepático, puede no haber sido causado por los neutrófilos estos juegan un papel importante en la fisiopatología de la HAA. En vista que estudios funcionales no pueden ser realizados en neutrófilos que están en el tejido hepático, nosotros hemos evaluado los neutrófilos en sangre periférica, esto se basa en datos proveniente de estudios en animales donde se ha demostrado una correlación entre el grado de activación de los PMN en tejido hepático y en sangre periférica. (28-29).

Es interesante remarcar que en este estudio los niveles básales de producción de superoxido son similares en los tres grupos. La incrementada producción de superoxido por los neutrófilos de pacientes con HAA frente a los estímulos (zymosan y fMLP) sugiere un estado de pre-estimulación.

Estudios previos han demostrado que la acción del fMLP como estimulante es a través de la activación de los siete receptores de membrana de la clásica proteína G (estos receptores están entrelazados). (30). La acción del zymosan es dependiente del grado de opsonización o sea de los niveles de complemento ya que actúan a nivel de receptores individuales de membrana como son las integrinas y receptores la fracción Fc del complemento. Con finalidad de eliminar esta variable que podría afectar nuestros resultados usamos una mezcla de suero de los controles normales para la opsonización del zymosan. De esta manera compensamos defectos en los niveles de complemento que es un hallazgo frecuente en pacientes con enfermedad hepática.

De todas las modalidades terapéuticas empleadas y evaluadas con la finalidad de mejorar el pobre pronostico de pacientes con HAA (1,2,27,31-38), únicamente el uso de esteroides y antioxidantes han demostrado cierta efectividad. (32-34,36,38).

La acción anti-inflamatoria de los esteroides esta en relación con la disminución en la producción de TNF-*, IL-6, IL-1, y principalmente en el efecto sobre la función de los neutrófilos. (39). Los esteroides disminuyen la adherencia y migración de los neutrófilos. (39-42). Además, Fukushima y col. han demostrado una reducción en la producción de superoxido. (40).

La generación de radicales libres de oxigeno altera el sistema antioxidante, incluyendo una reducción en los niveles de tocoferol, selenio, zinc, vitamina C y glutation. (1,2,39,43,44). tanto en el hígado como en otros tejidos y esto constituye el fundamente para el tratamiento con antioxidantes.

En conclusión este trabajo demuestra que los neutrófilos de pacientes con HAA manifiestan una respuesta exagerada a estímulos tanto al zymosan como al fMLP y esto explicaría en parte la hepatotoxicidad del alcohol. Al mismo tiempo este estudio establece una metodología para la evaluación de las diferentes modalidades terapéuticas que tienen por finalidad la de disminuir el proceso inflamatorio que al final esta en relación con la producción de radicales de oxígeno.

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FUENTE: Revista de Gastroenterología del Perú, Volumen 20, Nº2 2000
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